1.引物的功能是作为核苷酸聚合的起始点,引导DNA的合成。
能设定循环次数,及控制复制次数。
PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。
一般的循环次数选在30至40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多。
2.引物可以做为DNA复制开始时DNA聚合酶的结合位点,在细胞外的条件下,只有通过引物,DNA才可以开始进行复制。
引物是已知序列的DNA小片段。
3.引物是一小段单链DNA或RNA,引物可以做为DNA复制开始时DNA聚合酶的结合位点,在细胞外的条件下,只有通过引物,DNA才可以开始进行复制。
引物是人工合成的两段寡核苷酸序列,一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补,另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。
PCR技术的基本原理:在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的情况下,依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。
DNA聚合酶以单链DNA为模板,借助一小段双链DNA来启动合成,通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合,形成部分双链。
PCR反应步骤:模板DNA的高温变性:模板DNA经加热至93摄氏度左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;模板DNA与引物的低温退火:模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55摄氏度左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;引物的适温延伸:DNA模板、引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成新的双链。
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。
双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。
在聚合酶链式反应实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。
因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
这种批量复制DNA的技术就叫做PCR技术。