高压灭菌的构造原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。
在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。
在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
1.高压蒸汽灭菌锅内部压强是根据所灭的培养基不同而不同的，像我们常用的培养基，给他们灭菌的时候用的是115KPA 温度和压强是对应的，正常的高压蒸汽灭菌锅压力表上外圈表示温度，内圈表示压强，一个指针，也就是说温度是根据压强控制的，不同压强温度就不同；
2.水在100KPa的压力下沸点是121℃，此时蒸汽温度也是121℃，所以，高压灭菌装置在蒸汽温度121℃时，锅内压力达到100KPa。
安全阀是高压灭菌锅最后一道保护屏障。
在仪器工作异常持续加热使压力大于127兆帕时自动跳起泄压，从而保护仪器和操作者的安全。
锅下通常设有排水排气阀，灭菌时可将排水阀向左（向右为排水）旋转少许，让少量蒸汽排出，也有的灭菌设备上设有可调排气阀，灭菌时，始终保持排气阀处于微开状态，可起到排出冷空气的作用。
将需灭菌的培养基、蒸馏水或其它器皿放入灭菌锅内，关闭锅盖，检查排气阀、安全阀状态。
上下排气阀打开安全阀关合然后加热，方便空气排出，上、下排气阀都同时处于开启状态待有水蒸汽从上、下阀溢出，此状态保持7、8分钟后，即排出空气后上排气阀关合，下排气阀调小，安全阀保持关合状态。